MAKALAH KROMATOGRAFI
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
PENDAHULUAN
Kromatografi merupakan pemisahan fisiko kimiawi. Pemisahan ini dapat terjadi kalau interaksinya berulang. Kita dapat mengetahuinya dengan kuantitas ulangan yang dinyatakan dengan teori plate (terjadi pada setiap lempeng, banyaknya lempeng dinyatakan dengan N).
N =
Makin banyak N, pemisahan akan mengalami peningkatan dengan kesetimbangan interaksi.
Makin banyak N terjadi pelebaran puncak, karena :
• Senyawa tersebut berjalan ke bawah mengalami difusi kalau dibawa fase gerak.
Persamaan Van Deemter :
H =
Dasar yang digunakan dalam pemisahan adalah :
1. Pemisahan secara fisiko - kimiawi yang melibatkan interaksi antar fase gerak, fase diam, dan sampel.
2. Fase diam dan fase gerak yang digunakan.
Solute
fase gerak fase diam
Kalau fase geraknya gas :
Solute
fase gerak fase diam
Interaksi yang terjadi pada kromatografi, yaitu :
1. Adsorbsi, dengan melihat perbedaan stereochemistry
2. Partisi, dengan melihat kelarutan
3. Afinitas, dengan melihat BM
4. Ion Exchange, berdasrkan perbedaan muatan
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI (KCKT)
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam- asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis; menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.
Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu :
1. Low pressure (tekanan rendah)
2. High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal).
Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar, antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding.
Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap.
A. Prinsip kerja
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
Urutan skala polaritas : golongan fluorocarbon < golongan hidrokarbon < senyawa terhalogenasi < golongan eter < golongan ester < golongan keton < golongan alkohol < golongan asam.
B. Instrumentasi
1. Pompa
Pompa pendesakan tetap dapat dibedakan menjadi pompa torak dan pompa semprit. Pompa torak menghasilkan aliran yang berdenyut jadi memerlukan peredam denyut atau peredam elektronik untuk menghasilkan garis alas detektor yang stabil jika detektor peka terhadap aliran. Pompa semprit menghasilkan aliran yang tak berdenyut, tetapi tandonnya terbatas.
2. Injektor
Cuplikan harus dimasukkan ke dalam pangkal kolom (kepala kolom), diusahakan agar sesedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. Ada dua ragam utama aliran henti dan pelarut mengalir. Ada 3 macam system injector, yaitu :
a. stop flow : aliran dihentikan, injeksi dilakukan padakinerja atmosfir, system tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak diperngaruhi.
b. Septum : septum yang digunakan pada kckt sama dengan yang digunakan pada kromatografi gas. Injector ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60-70 atmosfir. Tapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut kromatografi cair. Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injector) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop valve : tipe injector ini umumnya digunakan unutk menginjeksi volume lebih besar dari 10μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunkan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi load, sampel diisi ke dalam loop pada kinerja atmosfir, bila valve difungsikan, maka sampel akan masuk dalam kolom.
3. Kolom
Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan atau kegagalan analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi menjadi kolom analitik dan kolom preparatif.
4. Detektor
Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen cuplikan di dalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berderau, rentang tanggapan liniernya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa.
• Jenis-jenis detektor :
- UV / Vis
- Retraktif indeks (RI) Detector
- konduktifitas detector
- Elektrokimia Detector
- PDA
- ELSD
- MS Detector
5. Fase gerak
Fase gerak memiliki syarat-syarat :
- murni, tanpa cemaran
- tidak bereaksi dengan kemasan
- sesuai dengan detektor
- dapat melarutkan cuplikan
- mempunyai viskositas rendah
- memungkinkan memperoleh dengan mudah cuplikan jika diperlukan
- harganya wajar
Gambar Instrumentasi :
C. Macam – Macam Optimasi
Tujuan Optimasi : Memisahkan sampai baseline dengan waktu seminimal mungkin. Rs yang bagus 1,5.
1. Optimasi Efisiensi Kolom
Adalah jumlah keterulangan interaksi. Efisiensi kolom dapat diukur N, yaitu kemampuan memberikan small bath. N akan maximal bila H minimal.
Efisiensi kolom dapat dilakukan dengan Van Deemter equation :
N = L / HETP
N = 5,54 ( tR / W)2
N dapat diperoleh dari hasil kromatogram dengan menginjeksikan suatu senyawa
sehingga mendapatkan puncak.
Cara meminimalkan HETP :
1. difusi eddy ( A )
o supaya cairan tidak kemana-mana perlu memperkecil partikel
o kerapatannya diperbesar
2. difusi longitudinal (B)
o memperkecil diameter partikel, kerapatan diperkecil
o u dipercepat, u = kecepatan alir fase gerak
o temperatur kolom diturunkan untuk mengatasi difusi laminer
3. non equilibrium mass transfer ( C )
terjadi karena fase gerak ditambah terus sebelum terjadi keseimbangan
o partikel diperkecil, luas area makin besar
o ketebalan fase diam cair makin tipis
o kerapatan diperbesar, u diperlambat supaya terjadi kesetimbangan
o temperatur dinaikkan
2. Optimasi Selektivitas
Untuk menentukan kemampuan kolom memisahkan. Tergantung dari sifat-sifat senyawa dan memilih berbagai interaksi yang ada dalam kolom.
- adsorpsi
perbedaan pada stereokimia ( orto : lebih cepat dilepaskan ke fase gerak sedangkan para : paling lama dilepaskan 2 tangan terikat)
- partisi
perbedaan pada kelarutan senyawa-senyawa yang akan dipisahkan
- ion exchange
pada muatan senyawa-senyawa
3. Optimasi Kapasitas
K’ = ns / nm
ns = jumlah molekul dalam fase diam
nm = jumlah molekul dalam fase gerak
dengan mengubah komposisi fase gerak kelarutan dalam fase gerak senyawa
tersebut akan berbeda.
D. Jenis-jenis KCKT
Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak, KCKT (kolomnya) dibedakan menjadi:
a. Kromatografi fase normal
Kromatografi dengan kolom konvensional dimana
Fase diam : normal (bersifat polar), misalnya Silika gel
Fase gerak : bersifat non polar
b. Kromatografi fase terbalik
Fase diam : sifatnya non polar, misalnya Silika gel direaksikan dengan klorosilan
Fase gerak : bersifat polar
Keuntungan kromatografi fase terbalik :
Senyawa yang polar akan lebih baik pemisahannya
Senyawa ionic dapat dipisahkan
Air dapat digunakan sebagi pelarut
E. Keuntungan dan Kerugian
a. Keuntungan
• Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
• Selektif : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang diinginkan.
• Peka : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10-9 gram) dari bermacam- macam zat. Detektor-detektor Fluoresensi dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10-12 gram). Detektor-detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT.
• Kolom dapat dipakai lagi : Berbeda dengan kolom kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali (reusable) . Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang sama sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven dan jenis solven yang digunakan.
• Ideal untuk molekul besar dan ion : zat – zat yang tidak bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat tersebut.
• Mudah memperoleh kembali sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut dapat dengan mudah sikumpulkan setelah melewati detector. Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan ksecuali untuk kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.
b. Kerugian
• Mahal
• Sampel yang digunakan jumlahnya sedikit
• Perlu tenaga ahli untuk mengoperasikan
Daftar Pustaka
A. Shafaati and B.J.Clark.J Pharm. Biomed. 1996 Anal.14,1547-1554
Christian G.D., 2003, Analytical Chemistry, Sixth, John Wiley & Sons Inc,New York
Mulja.Muhammad, Suharman,1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press,
Surabaya
Sastrohamidjojo,Harjono, 2005, Kromatografi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta
Skoog,DA,Holler,FJ,and West DM,1994,Analytical Chemistry, Six Edition, Hardcourt
Grace College,Florida
Underwood,A.L, 1996, Analisis Kimia Kuantitatif, 554, Penerbit Erlangga, Jakarta
Watson, D.G.,1999,Pharmaceutical Analysis, Churchill Livingstone,Edinburg
rafaeljosephhimawan.blogspot.com
