KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

I. PENDAHULUAN
Tekhnik analisa sederhana ini digunakan bangsa Roma dahulu untuk menguji zat warna. Sekitar 100 tahun lalu, ahli kimia Jerman Runge, Schoebien dan Goppelsroedn membuat kemajuan teknik ini sehingga lebih reprodusibel dan kuantitatif. Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada tahun 1938. Juga dikembangkan oleh Egon Stahl dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan lapis tipis. KLT merupakan kromatografi serapan tetapi dapat juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini segera populer karena memberi banyak keuntungan.

A. Keuntungan KLT dibanding dengan kromatografi lain :
1. KLT memberikan fleksibilitas yang lebih besar dalam hal memilih fase gerak.
2. Berbagai macam teknik untuk optimasi pemisahan seperti pengembangan 2 dimensi, pengembangan bertingkat, dan pembaceman penyerap dapat dilakukan pada KLT.
3. Proses Kromatografi dapat diikuti dengan mudah dan dapat dihentikan kapan saja.
4. Semua komponen dalam sampel dapat dideteksi.
5. KLT dibandingkan dengan kromatografi kolom serapan, keduanya mempunyai sistem fisika yang bersamaan.
6. KLT dibandingkan dengan kromatografi partisi kertas, keduanya mempunyai kesamaan dalam teknik eksperimennya.
7. Kromatografi kolom merupakan proses yang lambat, yang membutuhkan penyerap relatif dalam jumlah yang besar demikian pada cuplikan yang digunakan sedangkan dalam KLT hanya menbutuhkan penyerap dan cuplikan dalam jumlah sedikit dan noda-noda yang terpisahkan dilokalisir pada plat seperti pada lembaran kertas.
8. Bila dibandingkan dengan kromatografi kertas, metode KLT mempunyai keuntungan yang utama, yaitu membutuhkan waktu yang lebih cepat dan diperoleh hasil pemisahan yang lebih baik.
9. Penyerapan pada KLT mempunyai kapasitas yang lebih besar bila dibandingkan dengan kertas.
10. Sekarang pemisahan dengan KLT telah digunakan dalam kebanyakan lapangan-lapangan organik dan beberapa dalam kimia anorganik.

B. Penyerap-Penyerap
Dua sifat terpenting dari penyerap adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung pada mereka. Besar partikel yang biasa digunakan adalah1 - 25 mikron.

Penyerap-Penyerap dalam KLT

Zat padat Digunakan untuk memisahkan
Silika Asam-asam amino, alkaloid, gula, asam-asam lemak, lipida, minyak esensial, anion dan kation organik, sterol, terpenoid
Alumina Alkaloid, zat warna, fenol, steroid, vitamin-vitamin, karoten, asam-asam amino
Kieselguhr Gula, oligosakarioa, asam-asam dibasa asam-asam lemak, trigliserida, asam-asam amino, steroid
Bubuk selulose Asam-asam amino, alkaloid, nukleotida
Pati Asam-asam amino


II. IDENTIFIKASI DAN HARGA Rf
Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada KLT lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-reaksi warna. Sebagian besar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Konsep ” lempeng teori” lebih sukar digambarkan disini, tetapi jelaslah bahwa pemisahan itu dilakukan oleh keseimbangan berturutan cuplika dalam dua fase, satu diantaranya bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal.
Tetapi lazimnya untuk identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam KLT kurang tepat bila dibandingkan pada kertas.
Derajat retensi pada klomatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi Rf:

Jarak yang ditempuh senyawa terlarut
Rf =
Jarak yang ditempuh pelarut

Definisi koefisien distribusi K adalah

K = CS
CM

CS : kadar senyawa terlarut dalam fase diam
CM : kadar senyawa terlarut dalam fase gerak

Ada hubungan sederhana antara harga K dan Rf. Jarak tempuh rata-rata molekul terlarut berbanding langsung dengan kecepatan air pelarut dikalikan dengan fraksi waktu senyawa terlarut terdapat dalam fase gerak. Kemudian dapat dinyatakan sebagai jumlah molekul dalam setiap fase atau sebagai disrtibusi senyawa terlarut dalam dua fase:

jumlah mol senyawa terlarut dalam fase gerak
Rf =
Mol total senyawa terlarut dalam dua fase

= CM AM
CMAM + CSAS

Dimana AM dan AS adalah luas penampang melintang dua fase itu ( tegak lurus lempeng). Penjabaran lebih lanjut persamaan diatas, diperoleh:

Rf = AM = AM
AM + ASCS/CM AM + KAS

Harga–harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh hanya berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun demikian daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.
Pengukuran yang sering dipakai lainnya adalah menggunakan pengertian RX atau RSTD yang didefinisikan sebagai berikut:
RSTD = Jarak yang digerakkan oleh senyawa tak diketahui

Jarak yang digerakkan oleh senyawa standard diketahui

Faktor-faktor yang mempengaruhi gerak noda dalam KLT yang juga mempengaruhi harga Rf:
1. Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2. Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya. Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga-harga Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan solute yang sama, tetapi hasil akan dapat diulang dengan hasil yang sama, hanya akan diperoleh jika menggunakan penyerap yang sama juga ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen.
3. Tebal dan keratan dari lapisan penyerap. Meskipun dalam praktiknya tebal lapisan tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tidak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.
4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase gerak. Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase gerak dalam KLT adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.
5. Derajat kejenuhan dari uap dalam bajana pengembang yang digunakan.
6. Teknik percobaan. Arah dalam mana pelarut bergerak diatas plat. (Metode aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).
7. Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetesan culikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan tendensi penyebaran noda-noda dengan kemungkonan terbentuknya ekor dan efek tak keseimbangan lainnya hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
8. Suhu. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.
9. Keseimbangan. Ternyata bahwa keseimbangannya dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, makan akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang terbentuk cekung dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi daripada dibagian tengah. Keadaan ini harus dicegah.

III. FASE DIAM
Dalam KLT, fase diam harus mudah didapat. Keistimewaan KLT adalah lapisan tipis fase diam dan kemampuan pemisahnya.
1. Silika Gel
Pada umumnya sebagai fase diam digunakan silika gel. Untuk penggunaan dalam suatu tipe pemisahan perbedaan tidak hanya pada struktur, tetapi juga pori-porinya dan struktur lubangnya menjadi penting, di samping pemilihan fase gerak. Dalam perdagangan silika gel mempunyai ukuran 10-40µ. Ukuran ini terutama dipengaruhi oleh ukuran porinya yang bervariasi dari 20-50Å. Silika gel berpori 80-150 dinamakan berpori besar. Luas permukaan silika gel bervariasi dari 300-1000m2/g. Silika gel sangan higroskopis. Pada kelembapan relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Masalah aktivitasi silika gel tidak begitu mempengaruhi kebanyakan jenis pemisahan, tetapi deaktivitas silika gel merupakan hal yang perlu dipertimbangkan. Beberapa prosedur kromatografi terutama pemisahan yang menggunakan larutan pengembang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12% b/b. Derajat deaktivitasi ditentukan oleh kelembapan relatif kamar dimana pemisahan dilakukan dan lempeng silika gel disimpan.


Ada beberapa macam silika gel yang beredar diantaranya:
a. Silika gel dengan pengikat. Umumnya sebagai pengikat adalah CaSO4 (5-15%). Jenis ini dinamakan Silica Gel G. Disamping itu ada juga pati sebagai pengikat dan dikenal sebagai Silica Gel S. Tetapi penggunaan pasti mempunyai kelemahan, terutama jika penentuan lokasi bercak dengan asam sulfat.
b. Silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi. Jenis silika gel ini biasanya berfluoresensi kehijauan jika dilihat pada sinar ultraviolet panjang gelombang pendek. Sebagai indikator biasanya digunakan timah kadmium atau mangan-timah silika aktif. Jenis ini dikenal misalnya Silica Gel GF atau GF254.
c. Silika gel tanpa pengikat. Lapisan ini dibanding dengan yang mengandung CaSO4 menunjukkan lebih stabil. Beberapa produk dinamakan Silica Gel H atau Silica Gel N.
d. Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indikator Fluoresensi.
e. Silika gel untuk keperluan pemisahan prepartif. Untuk keperluan pemisahan preparatif dapat digunakan Silica Gel PF254 + 366.
Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penyerap fase terbalik dengan cara menbacemnya menggunakan parafin cair. Minyak silikon, atau dengan lemak. Lempeng fase terbalik jenis ini digunakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid.

Bahan-Bahan Pembacem Silika

Bahan Pembacem Tujuan
Carbomer Identifikasi neomisin sulfat
Tetradekana Identifikasi sepradin dan atau identifikasi sefaklor
Tembaga sulfat 2% dan etilendiamin 2% Pemisahan 7 senyawa barbiturat
Tembaga sulfat 0,1% Pemisahan obat-obat golongan sulfonamida
Seng asetat 1% Pemisahan 7 obat golongan antihistamin
EDTA Pemisahan seratonin, epinrfrin, dan non-epinefrin

2. Alumina
Setelah silika gel,alumina merupakan fase diam yang paling banyak digunakan. Alumina termasuk kelompok fase dian dengan aktivitas tinggi. Alumina untuk KLT bersifat sedikit basa (pH 9), disamping itu ada juga alumina netral (pH 7) dan alumina asam (pH 4). Dalam banyak hal digunakan CaSO4 sebagai pengikat. Pengikat ini dapat menurunkan kebebasan alumina sampai batas tertentu. Seperti silika gel, alumina terdapat dengan atau tanpa bahan pengikat dan juga denga indikator fluoresensi. Simbol yang digunakan untuk suatu produk tertentu sama dengan yang digunakan untuk silika gel (G, H, P, F). Sekarang alumina paling banyak digunakan untuk pemisahan senyaw yang kurang polar. Setelah deaktivitasi penuh, dapat digunakan untuk pemisahan senyawa hidrofil kuat seperti gula atau asam amino.
3. Keiselguhr
Keiselguhr merupakan penyerap dengan aktivitas rendah. Tidak banyak digunakan dalam KLT. Penggunaan utama sebagai padatan pendukung untuk fase diam dalam kromatografi partisi.
4. Selulosa
Dengan digunakan selulosa untuk fase diam KLT, diperoleh mekanisme yang sama seperti kromatografi kertas. Perbedaan-perbedaannya terutama pada panjang serat, yang pada KLT panjang serat lebih pendek. Panjang serat bervariasi sari 2-20µ. Serat pendek menyebabkan difusi rendah selama pengembangan dan menghasilkan noda lebih kecil. Fakta ini memungkinkan pemisahan pada jarak lebih pendek daripada kromatografi kertas, juga waktu pemisahan lebih pendek. Tetapi dibandingkan dengan fase diam lain, misalnya fase diam anorganik, waktu yang diperlukan untuk suatu pemisahan lebih lama.
Selulosa untik KLT terbagi dalam dua bentuk
a. selulosa serat asli, misalnya MN 300
b. selulosa mikrokristal, misalnya Avicel.
Pada KLT selulosa digunakan untuk memisahkan senyawa hidrofil. Kriteria pemilihan pelarut pada kromatografi kertas padat diterapkan disini. Salah satu kelemahannya, tidak boleh menggunakan asam sulfat untuk menentukan letak noda.

Fase diam dapat dikelompokkan berdasarkan beberapa hal, misalnya berdasarkan sifat kimianya, dapat dikelompokkan dalam senyawa organik dan anorganik. Jika dilihat dari mekanisme pemisahan, fase diam dikelompokkan:
1. Kromatografi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr)
2. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, slika gel)
3. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukar ion)
4. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel)

Ada beberapa fase diam yang sulit dikelompokkan, misalnay poliamida, polimer organik berporiseperti Porapak. Setiap jenis fase diam sangat bervariasi, hal ini disebabkan oleh:
1. struktur fase diam
2. ukuran
3. kemurnian
4. zat tambahan sebagai pengikat dll.
Oleh karena itu data suatu publikasi tidak menjamin, walaupun semua cara percobaan telah dijelaskan tetapi spesifikasi fase diam tidak dinyatakan.


IV. FASE GERAK
Pemilihan dari fase bergerak tergantung pada faktor-faktor yang sama seperti dalam pemisahan kromatografi kolom serapan. Sebaiknya menggunakan campuran pelarut organik yang mempunyai polaritas serendah mungkin karena mengurangi serapan dari setiap komponen dari campuran pelarut. Jika komonen-komponen yang mempunyai sifat polar yang tinggi (terutama air) dalam campuran cukup akan merubah sistem menjadi sistem partisi. Campuran yang baik memberikan fase-fase bergerak yang mempunyai kekuatan bergerak sedang, tetapi sebaiknya dicegah sejauh mungkin mencampur lebih dari dua komponrn terutama karena campuran yang lebih kompleks cepat mengalami perubahan fase terhadap perubahan suhu. Kemurnian dari pelarut adalah lebih penting dalam KLT daripada bentuk-bentuk kromatografi lain, karena disini digunakan sejumlah materi yang sedikit. Sistem yang paling sederhana adalah dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat dengan mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut ini adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimalkan fase gerak:
1. Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
2. Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
3. Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga RF secara signifikan.
4. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuaran pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan elusi solut-solut yang bersifat basa dan asam.


V. METODOLOGI
A. PEMBUATAN LEMPENG
Ukuran lempeng gelas yang sering digunakan 20x20, 20x10, dan 20x20. Sebelum dilapisi lempeng kaca ini dibersihkan dengan air dan deterjen, kemudian dikeringkan. Cuci lagi dengan aseton dan permukaan kaca yang bersih jangan sampai tersentuh. Penyerap dibentangkan diatas permukaan penyokong yang baik, biasanya digunakan plat kaca. Ukuran yang digunakan tergantung pada jenis dari pemisahan yang akan dilakukan dan jenis dari bejana kromatografi. Untuk pemisahan secara kualitatif yang cepat sering digunakan gelas mikroskop (microscope slide). Yang terpenting adalah bahwa permukaan dari plat harus rata.
Langkah yang pertama adalah membuat penyerap menjadi bubur dengan air, biasanya menggunakan perbandingan x gram penyerap dan 2x ml air. Bubur diaduk dengan baik dan dibentangkan diatas plat kaca dengan berbagai cara. Ratakan bubur itu untuk 4-5 lempeng (20x20 cm) dalam waktu 4 menit jika digunakan bahan pengikat dalam bubur penyerap itu dapat juga ditambahkan dapar untuk membuat keasaman tertentu atau kandungan air pada lapisan fase diam Tebal lapisan adalah merupakan faktor yang paling penting dalam kromatografi lapis tipis. Tebal standard adalah 250 mikron. Lapiasan-lapisan yang lebih tebal (0,5-0,2 mm) digunakan untuk pemisahan-pemisahan yang sifatnya besar, dengan menggunakan penyerap hingga 250 mg untuk plat dengan ukuran 20x20 cm. Salah satu kesukaran dengan lapisan tebal adalah adanya tendensi mengelupas bila kering. Pindahkan lempeng itu hati-hati pada rak dan setelah 30 menit keringkan pada 100-120oC selama 1 jam untuk mengaktifkan fase diam. Dinginkan dan simpan lempeng itu dalam desikator.
Pada dasarnya ada 4 cara yang digunakan dalam pembuattam lapis tipis, yaitu pembentangan, penuangan, penyemprotan dan pencelupan. Metode pembentangan dan penyemprotan dapat dikerjakan baik dengan tangan atau dengan alat. Banyak pemakai yang tidak menggunakan metode penuangan secara mekanik. Jika penyerap sangat halus dan partikel-partikelnya homogen dan jika tidak menggunakan pengikat, maka bubur dapat dituangkan diatas plat dan dibiarkan hingga melapisinya. Pembuatan dengan penuangan biasanya mudah dengan menggunakan jenis alumina yang tertentu tetapi dalam pembuatan bubur tidak menggunakan air, meliankan menggunakan cairan yang mudah menguap seperti etanol (atau campuran etanol-air) atau etil asetat.



Plat Kaca Kromatografi Lapisan Tipis, Ukuran 20 x 20 cm untuk Kromatografi Penaikan Satu Arah


Plat-plat yang kecil, seperti gelas mikroskop dapat dilapisi dengan pencelupan dalam bubur dari penyerap dalam kloroform atau zat cair mudah menguap yang lain. Sekali lagi tebal lapisan yang pasti tidak diketahui dan kemungkinan lapisan tidak dapat dibuat dengan baik, meskipun demikian metode ini cukup memuaskan untuk membuat sejumlah dari plat-plat untuk pemisahan secara kualitatif dengan cepat. Plat-plat yang dibuat dengan zat-zat cair organik yang mudah menguap tidak perlu pemanasan lebih lanjut. Penyentuhan dengan jari-jari akan merusak lapisan dan akan melepaskan partikel-partikel dari permukaan.

Perbandingan Bahan dan Pelarut untuk Pembuatan Lempeng

Nama Perbandingan bahan dan air
Silika gel 1 : 1,5
Silika gel G atau GF 1 : 2
Alumina 1 : 1,1
Alumina oksida G 1 : 2
Serbuk selulosa MN 300 1 : 5
Serbuk selulosa MN 300 G 1 : 6
Keiselguhr G 1 : 2
Serbuk poliamida 1 : 9 (kloroform-metanol 2 : 3)

B. PENOTOLAN CUPLIKAN
Pemisahan pada KLT yang optimal akan diperoleh hanya jika penotolan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi. Penotolan dapat dilakukan dengan mikropipet atau dengan mikrosyringe, biasanya diperlukan 1-20 ul. Volume lebih besar dari itu dapat ditotolkan bertahan dalam bagian-bagian kecil dengan pengeringan di antara penotolan itu. Kelebihan beban menyebabkan bercak asimetri dan perubahan harga Rf, yang dapt dihindari cuplikan kurang dari 10-20 µg.
Pada lempeng KLT efisien tinggi (KLTET) (biasanya 10x10 cm atau 10x20 cm) hanya diperlukan cuplikan dalam nano sampai pikogram setiap bercak. Diameternya harus tidak lebih 0,2 µl. Diperlukan teknik penotolan khusus, yaitu dengan syringe 1 µl yang dihubungkan dengan skrup mikrometer atu sebuah kapiler platina iridium dalam aplikator otomatis.
Pada lempeng KLT konvensional (20x20 cm, 10x20 cm, 5x20cm, tebal 0,2 mm) cuplikan biasanya ditotolkan sebagai bercak bulat atau garis, 1,5-2,0 cm dari tepi bawah dan dimulai dan diakhiri kira-kira 0,5 cm dari samping kaca dan noda-noda diteteskan masing-masing pada jarak 1 cm dari pusat noda. Penempatan noda diatas plat kira-kira 1 cm dari salah satu ujungnya dimana ujung ini nantinya dicelupkan dalam pelarut. Bercak sebaiknya berukuran sama dan mempunyai diameter 3-6 mm. Kedudukan noda tidak dapat diberi tanda dengan pensil, seperti dikerjakan pada kertas, hingga penunjuk noda dapat digunakan, misalnya penggaris yang diletakkan si samping plat kaca.
Garis awal dapat diberi tanda pada ujung dari plat dengan pensil dan garis akhir dapat dibuat di bagian atas dengan menggoreskan pensil dan disebabkan goresan ini aliran pelarut akan ditahan bila permukaan pelarut sampai pada garis. Jangan terlalu lama mencelupkan plat dalam bejana bila permukaan pelarut telah mencapai garis akhir, karena oleh pengaruh difusi dan penguapan dapat menyebabkan pemancaran dari noda-noda yang terpisah. Ujung plat yang dicelupkan dalam fase bergerak jangan dibiarkan hingga rusak. Bila akan dilakukan pemisahan dua jalan, maka lapisan dari dua sisi yang berdekatan tidak perlu dihilangkan.

C. PENGEMBANGAN KROMATOGRAFI
Bila plat kromatografi telah disiapkan dan cuplikan telah ditempatkan di atasnya, maka ia dimasukkan dalam bejana yang cocok dengan ujung yang paling bawah, dimana cuplikan detempatkan, dicelupkan dalam fase bergerak yang telah dipilih sedalam kira-kira 0,5-1,0 cm. Biasanya dua plat dapat dimasukkan dalam bejana, dalam hal ini akan diperoleh kromatografi penaikan. Bejana diusahakan jangan sampai bocor. Sering tidak memerlukan waktu kesetimbangan, tetapi untuk meyakinkan homogenitas dari atmosfer dalam bejana, maka dinding dalam bejana dilapisi dengan lembaran kertas saring yang ujungnya direndam dalam fase gerak. Sedapat mungkin menggunakan bejana yang sekecil mungkin, sehingga atmosfer dalam bejana mempunyai volume sekecil mungkin. Untuk plat kaca yang kecil, microscope slide, sebagai bejana dapat dipakai gelas piala yang mempunyai kapasitas sekitar 500 ml, juga dinding sebelah dalamnya dapat dilapisi dengan kertas saring yang ujungnya dicelupkan dalam fase gerak. Permukaan pelarut yang terdapat di dalam jangan sampai terhubung dengan atmosfer luar, karena hal ini mengakibatkan komponen-komponen yang mudah menguap lepas oleh penguapan
Pengembangan menurun atau horisontal dapat digunakan dalam beberapa kasus,yaitu pada lapisan tebal atau dengan fase gerak kental. Fase gerak dialirkan pada lapisan melalui kertas saring. Pengembangan horisontal bisanya digunakan pada KLTET. Untuk memperbaiki pemisahan dapat dilakukan teknik sebahgai berikut:
1. Pengembangan Berlanjutan
Fase gerak dialirkan pada bagian atas dari lempeng pengembangan horisontal dan diisap oleh fase diam. Teknik ini terutama digunakan untuk senyawa yang mempunyai harga Rf 0,05-0,2 setelah pengembangan pertama.
2. Pengembangan Dua Dimensi
Cuplikan ditotolkan pada lempeng 3-4 cm dari salah satu pojok dan dikembangkan seperti biasanya. Lempeng kemudian diputar 90o sehingga pita pemisahan dari hasil pengembangan pertama terletak pada bagian bawah lempeng, dan kemudian dilakukan pengembangan kedua. Fase gerak harus diganti sehingga diperoleh pengaruh pemisahan berbeda pada arah kedua. Teknik ini berguna untuk cuplikan yang mengandung banyak senyawa penyusun.
3. Pengembangan Sirkuler
Pada kromatografi sirkuler fase gerak dialirkan dengan sebuah sumbu atau pompa melalui pipa kapiler di tengah lapisan fase diam. Senyawa terlarut bergerak cepat dari tengah penotolan menghasilkan lingkaran-lingkaran sempit.
4. Pengembangan Beberapa Kali
Pada fase gerak biasanya mudah menguap dapat diuapkan setelah pengembangan dan lempeng itu spat dikembangkan lagi dengan fase gerak sama atau fase gerak lain. Teknik ini dinamakan pengembangan beberapa kali. Bercak cuplikan berbentuk bulat telur dengan aksisi pendek kepada arah fase gerak bergerak.
5. Metode Identifikasi
Untuk melihat senyawa tak berwarna pada lempeng, biasanya digunakan metode sebagai berikut:
a. Melihat kromatografi di bawah sinar ultraviolet (254 atau 366 nm)
• Pada lapisan berfluoresensi, misalnya Silica gel GF254, bercak muncul sebagai noda hitam.
• Untuk senyawa berfluoresensi digunakan lapisan biasa, bercak terlihat berfluoresensi.
b. Menyemprot dengan pereaksi yang menghasilkan warna dan atau berfluoresensi.
6. KLT Preparatif
Pemisahan preparatif sering dilakukan pada lapisan yang agak tebal (0,5-2,0 mm). Cuplikan ditotolkan sebagai garis sempit dengan alat yang sesuai. Ukuran maksimum cuplikan tergantung pada jumlah relatif senyawa penyusun, perbedaan Rf-nya dan lebar lempeng. Jika selisih harga Rf lebih besar dari 0,2 dapat ditotolkan 50-1—mg cuplikan pada lempeng 20 cm.




Kromatografi lapis tipis
jenis penurunan

a. tempat pelarut
b. gulungan kertas
c. lapisan kromatografi


IV. CONTOH PERCOBAAN TEKNIK KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

A. PEMBUATAN LAPIS TIPIS KECIL
1. Dua buah mikroskop yang dilekatkan satu sama lain dicelupkan dala bubur silika gel. (Bubur silika gel dibuat dengan mencampurkannya dengan klofoform yang diaduk hingga benar-benar homogen)
2. Setekah dicekupkan diangkat kembali, biarkan hingga kering di udara. Setelah kering bagian sisi yang terletak disebelah dalam dari masing-masing gelas dibersihkan dengan kertas kering.

B. PEMBUATAN LAPIS TIPIS BESAR
1. Timbang silika gel sebanyak 12 gram, tambahkan air sebanyak 27 ml, diaduk sampai homogen. (Air yang digunakan adalah air suling)
2. Tuangkan pada gelas preparat besar ukuran 20x20 cm dan usahakan mendapatkan tebal permukaan yang serata mungkin dengan cara mengetap-ngetapkan di atas gabus.
3. Plat gelas yang telah dilapisi silika gel dikeringkan untuk di ”aktif” kan dengan jalan memanaskan dalam oven pada suhu sekitar 100oC selama 30 menit (semakin lama semakin baik).

C. PEMBUATAN CUPLIKAN
Dipakai zat dari tumbuh-tumbuhan misal kunir, daun atau bunga-buangaan, dapat juga zat organik yang tak berarna.
1. Kunir, daun atau buanga dipotong-potong dan dilumatkan sampai halus dalam lumpang porselin dan diekstrak dengan pelarut organik, kloroform (dapat menggunakan pelarut lain).
2. Ekstrak disaring, ambil bagian yang terlarut dalam kloroform kemudian diuapkan hingga diperoleh larutan yang pekat.

D. PEMBUATAN KROMATOGRAM
1. Di atas lapisan tipis teteskan zat yang akan dikromatografikan dengan pipa kapiler, pada jarak kira-kira 1 cm dari bagian bawah kaca. Untuk plat yang kecil noda berupa titik sedang plat yang besar, 20x20 cm berupa deretan titik-titik sehingga menbentuk garis. Biarkan beberapa saat hingga kering.
2. Lapisan tipis yang mengandung cuplikan dimasukkan dalam suatu bejana yang berisi fase gerak. (Untuk lapisan tipis yang kecil dapat ditempatkan dalam gelas piala). Bagian yang mengandung cuplikan dicelupkan dalam fase bergeak, noda jangan sampai tercelup dalam fase bergerak.
3. etelah fase bergerak naiksampai hampir ujung atas lapisan, lapisan tipis diambil dari bejana/gelas piala. Untuk plat kecil, batas fase bergerak dan noda-noda diberi tanda. Biarkan kering diudara.
4. Untuk mengetahui lokasi noda (bila noda tidak kelihatan), maka setelah lapisan tipis kecil kering dimasukkan dalam gelas piala yang di dalamnya telah diberi kristal yood.
5. Tentukan harga Rf untuk lapisan tipis yang kecil.
6. Penanganan plat yang besar selanjutnya.
Bila dikehendaki untuk mendapatkan hasil pemisahan maka pita-pita yang merupakan komponen-komponen senyawa masing-masing dikeruk dan dikumpulkan secara terpisah. Tiap-tiap bagian dicuci dengan kloroform yang kemudian perlu diuji lebih lanjut, dengan menggunakan lapisan tipis, untuk mengetahui apakah masing-masing bagian merupkan komponen tunggal atau masih merupakan campuran.































KEGUNAAN KLT UNTUK ANALISA OBAT

1. Adiploidon (Iodipamid)
(dalam Bulk)
Fase diam : Silika HF254
Fase gerak : n-butanol-asam asetat-air (4 : 1 :5)
Deteksi : UV 253 nm
Penyiapan sempel : Sebanyak 1 mg dilarutkan kedalam metanol 0,08%-NaOH

2. Alanin
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : n-butanol-air-asam asetat (3 : 1 :1)
Deteksi : Ninhidrin
Penyiapan sampel : Dilarutkan kedalam etanol 60%

3. Albenazol
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Metil klorid-asam asetat-eter (6 :1 : 1)
Deteksi :UV panjang gelombang pendek
Penyiapan sampel : Sebanyak 50 mg sampel dilarutkan kedalam 3,0 ml asam asetat lalu diencerkan sampai 50,0 ml dengan asam asetat. Sebanyak 1,0 ml larutan ini diencerkan sampai 100 ml dengan asam asetat.

4. Alfadolon Asetat
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Toluen-etil asetat (1 : 1)
Deteksi : Seri sulfat
Penyiapan sampel : Dilautkan ke dalam metanol-kloroform (1 : 1)

5. Alkometason Dipropianat
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Kloroform-aseton (7 : 1)
Deteksi : UV 350 nm
Penyiapan sampel : Dilarutkan ke dalam metanol-diklorometan
(1 :2)

(dalam krim)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Kloroform-aseton (7 : 1)
Deteksi : UV 350 nm
Penyiapan sampel : Ditambah metanol, dipanaskan pada suhu 60oC sampai sempel meleleh, bagian yang tidak larut dipindahkan, dan digojok kuat.

6. Alopurinol
(dalam bulk)
Fase diam : Selulosa
Fase gerak : Butanol-amonium hidroksida 5M (jenuh)
Deteksi : UV 254 nm
Penyiapan sampel : Dilarutkan kedalam dietilamin 10%

7. Amikasin
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : metanol-kloroform-amonium hodroksida (60 : 30 : 25)
Deteksi : Ninhidrin
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam air

8. Amiodaron Hodroklorida
(dalam bulk)
Fase diam : Silika HF254
Fase gerak : Kloroform-metanol-asam asetat (80 : 15 : 5)
Deteksi : UV 254 nm
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol.

9. Amitriptilin
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Metanol-Kloroform-NH4OH (15 : 135 : 1
Deteksi : UV 254 nm
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol.

10. Amoksisilin
(dalam tablet, kapsul, suspensi)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Metanol-pirimidin-kloroform-air (90 : 10 : 80 : 10)
Deteksi : Ninhidrin
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam HCl 01 N.

11. Ampisilin
(dalam kapsul, suspensi oral)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Aseton-toluen-air-asamasetat (650 : 100 : 100 : 25)
Deteksi : Ninhidrin
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam aseton-HCl 0,1 N (4 :1)

12. Apomorfin Hidroklorida
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Asetonitril-asam format- etil asetat-metilen klorid
(30 : 5 : 30 : 5)
Deteksi : Uap amonia
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol.

13. Artemether
Fase diam : Silika gel 50F-254
(10x10 cm with 250 µm)
Fase gerak : Toluen-etil asetat-asam format (8 : 2 : 0,3)
Deteksi : Asam sulfat-anisaldehid
Penyiapan sampel : Obat diekstraksi dengan 10 ml kloroform. Untuk memastikan ekstraksi larutan disonokasi selama 30 menit. Larutan yang dihasilkan dibiarkan selama 30 menit an supernatannya diambil lalu dilakukan penotolan, visualisasi, dam scanning.

14. Asam Askorbat
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Metanol-aseton-air (20 : 4 : 3)
Deteksi : UV
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam etanol absolut.

15. Asam Folat
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Etanol-propanol-amonium hidroksida (3 : 1 :1)
Deteksi : UV 350 nm
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol-amonium hidroksida (9 : 2)

16. Asam Mefenamat
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Isobutanol-amonium hidroksida (3 : 1)
Deteksi : UV 254 nm
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol-kloroform (1 : 3)

17. Asetaminofen
(dalam bulk)
Fase diam : Silika gel
Fase gerak : Heksan-aseton (75 : 25)
Deteksi : UV
Penyiapan sampel : Sebanyak 1 g sampel dipindahkan kedalam tabung setrifus gelas 15 ml bertutup rapat lalu ditambah dengan 5 ml eter, digojok selama 30 menit, disentrifus selama 15 menit pada 1000 rpm.

18. Atropin
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Kloroform-aseton-dietilamin (5 : 4 : 1)
Deteksi : Iodoplatinat
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol.

19. Atropin Sulfat
(dalam sediaan injeksi)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Kloroform-dietilamin (9 : 1)
Deteksi : Iodoplatinat
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam etanol.

20. Azatadin Maleat
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Toluen-2 ropanol-dietilamin (10 : 10 : 1)
Deteksi : UV
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol-toluen (1 : 1).

21. Baklofen
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Butanol-air-asam asetat (4 : 1 : 1)
Deteksi : Uap klor
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam etanol-asam asetat ( (4 : 1).

22. Barbital
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Amonium hidroksida-kloroform-etanol (5 : 80 : 15)
Deteksi : UV 254
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam etanol.

23. Basitrasin
(dalam bulk)
Basitrasin merupakan suatu polipeptida yang dihasilkan dari pertumbuhan organisme kelompok Licheniformis dan Bacillus subtitis.
Fase diam : Silika
Fase gerak : Butanol-pirimidin-etanol-asam asetat
(60 : 15 : 10 : 6 : 5)
Deteksi : Triketohidrinen hidrat 1% lalu dipanaskan
Penyiapan sampel : Dilarutka dalam metanol-toluen (1: 1)

24. Benorilat
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Metilen klorid-asam asetat-eter (80 : 5 : 15), lalu dikeringkan dikembangkan lag dengan fase gerak kedua: 2,2,4-trimetilpenten-eter-asam format (45 : 45 : 10)
Deteksi : UV 254
Penyiapan sampel : Dilarutka dalam metanol-kloroform (1 : 9)

25. Benzokain (Etil aminobenzoat)
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak :Propanol-amonium hidroksida 10% (88 : 12)
Deteksi : UV
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam alkohol 40%

26. Benztropin
Fase diam : Silika
Fase gerak :Etanol-amonium hidroksida 13,5 M
Deteksi : Iodoplatinat
Penyiapan sampel : Diuapkan dan residu dilarutkan dalam aseton.

27. Biperidin
(dalam bulk)
Fase diam : Silika (diperlakukan dengan basa)
Fase gerak : Toluen-metanol (965 : 35)
Deteksi : Iodoplatinat
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam kloroform

28. Bupivakain Hidroklorida
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Heksan-isopropilamin (97 : 3)
Deteksi : Char
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalan isopropilamin-kloroform
(1 : 99)

29. Dasatinib
Merupakan inhibitor tirosin kinase pertama yang disetujui.
Fase diam : Silika gel 60F-254
Fase gerak : Toluen-kloroform (7 : 3 v/v)
Deteksi : Densitrometri dilakukan pada 280 nm dengan mode absorbansi
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol

30. Deksklorfeniramin
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Isopropanol-amonium hidroksida 10% (7 : 3)
Deteksi : UV
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam etil asetat

31. Dekstrometorpan
Fase diam : Silika
Fase gerak : amonium hidroksida-metilen klorid-metanol-toluen-etil asetat (2 : 10 : 13 : 55 : 20)
Deteksi : Dragendroff
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol

32. Dekstromoramid
Fase diam : Silika
Fase gerak : Metanol
Deteksi : Dragendroff
Penyiapan sampel : Serbuk dicampur dengan metanol lalu dusaring

33. Desipramin
Fase diam : Silika
Fase gerak : Toluen-metanol (95 : 5)
Deteksi : Kalium dikromat
Penyiapan sampel : serbuk digojok dengan metanol, lalu disaring

34. Diazepam
(dalam bulk)
Fase diam : Silika
Fase gerak : Heptan-etil asetat (1 : 1)
Deteksi : UV 254
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam aseton

35. Ketamin
(dalam bulk)
Fase diam : Silika yang dilapisi dengan bufer fosfat
Fase gerak : Benzen-metanol-amonium hidroksida
Deteksi : Dragendroff
Penyiapan sampel : Dilarutkan dalam metanol